翻譯時如何確保選擇正確 tRNA？

　　云銷雨霽，業余生物工程師

　　這個問題其實想到了很數人忽略的一個要點。

　　在中學生物學，甚至是本科生物學，標準答案都是“堿基互補配對”。這個答案 其實不太經得住推敲。

　　堿基互補配對，是說攜帶氨基酸的 tRNA 上面三堿基的反密碼子與 mRNA 上面三堿基的密碼子互補配對，從而選擇得到正確的 tRNA。

　　暫時不考慮簡并的情況，試想，如果只有一個堿基發生了錯配，會有什么影響？

　　這個要考慮能量的差異，也就是說，三堿基配對的自由能變化

　　和只有兩個堿基配對

　　之間的差異。這個差異非常小，只有~5.5kcal/mol，在這種能量差異下，對 tRNA 的選擇大約會有 1% 的錯誤率。一般的蛋白質平均有幾百個氨基酸，那么，如果核糖體真的是單純依靠堿基互補配對選擇 tRNA，那么蛋白的錯誤率是非常高的，幾乎沒有蛋白能夠完全正確的合成出來。這種情況下，蛋白質的成品率過低，即使存在質量控制，也很難得到具有正確序列的蛋白質。

　　與此對應的，實驗測定的核糖體的錯誤率小于 0.01%，遠遠小于堿基互補配對的能量差異所能達到的值。

　　實際上，堿基互補配對是一個被過分應用的概念，很多時候堿基互補配對是一個基礎，但是并不是最重要的決定因素。DNA 合成的發生錯誤的概率大約是

　　，而堿基互補配對的能量差異同樣是小的可憐，只能保證大約 1% 的突變率（DNA 合成之后會有額外的校對和修復，能夠達到

　　的突變率，這里只考慮 DNA 聚合酶合成 DNA 這一步的準確率）。這個如果只考慮堿基互補配對的話，是完全無法解釋的。

　　保證生物系統極高準確率的核心，在于結構而非序列。

　　就像生活中的很多例子一樣，如果一次操作準確率不能保障，那么可以二次篩選。對于 tRNA 選擇問題來說，生物體是先從眾多 tRNA 中挑選一個，然后再從選中的 tRNA 中再選一遍，每一次挑選中，挑中錯誤的 tRNA 的概率都是能量差異決定的 1%，兩次挑選之后就變成了 0.01%。

　　那么，怎樣實現多輪挑選呢？

　　必須要保證，任何反應物（tRNA）只有通過了第一輪篩選，才能進入第二輪。 在微觀世界，這種方法只有一個，就是利用額外的能量輸入。這個問題最早是 Hopfield 在 1974 年解決的，他提出了 kinetic proofreading 的概念，并發表在 PNAS 雜志，隨后 Ninio 在 1975 年又作出了額外的闡釋。

　　具體到核糖體選擇 tRNA 上面，核糖體選擇 tRNA 的過程，可以表示成下面這個結合反應

　　T 是 tRNA，R 是核糖體。

　　所有的 tRNA 都是非常相似的，那么不同的 tRNA 結合到核糖體上面的速率是近似相等的，也就是

　　但是由于結合能量的差異（只有兩個堿基配對的結合不如三個堿基全部配對的結合緊密），解離速率有所不同，即

　　如果 tRNA 在結合核糖體之后，核糖體立即催化肽鍵的生成，即

　　P 代表新生的蛋白質。那么，錯誤 tRNA 被裝配的概率就是能量差確定的 1%

　　但是，如果核糖體不是立即催化多肽的合成，而是等一段時間。而且保證，在等待的時間內，新的 tRNA 不能進入核糖體，但是現在結合的 tRNA 可以離開核糖體，即

　　最后一步解離是單向箭頭，那么，由于解離反應的速率差異，在等待相同的時間之后，正確的 tRNA 的比例會大幅上升。

　　這張圖來自維基百科，解離反應近似是指數衰減。如果把橫坐標看作是時間，那么縱坐標就是這一時刻仍然保持結合的比例。如果把圖中的紅線當作是正確的 tRNA 的解離曲線，綠線當作錯誤的 tRNA 的解離曲線，那么可以看到，隨著時間推移，在每一個橫坐標（時間）上， 紅線的縱坐標對綠線的縱坐標的比值在不斷上升。回到核糖體上，就是隨著等待時間的延長，存留下來的 tRNA 的正確率在上升。

　　當然，這種等待也有副作用，很多 tRNA，即使是正確的 tRNA，也都離開了；但是只要再從頭開始結合就可以再繼續合成反應，這樣合成蛋白質的效率變低了，但是正確率大大提高。

　　那么如何保證核糖體，暫時不合成蛋白，不再接受新的 tRNA，同時還能讓現在 tRNA 自由解離呢？

　　生物體使用了幾個稱為為 EF 的蛋白，這個蛋白做的事情很簡單，就是結合到 tRNA 上面，把 tRNA 送進核糖體。核糖體的結構保證了 tRNA 自己進不去，必須要 EF 協助才能進入，這樣就保證了不會有 tRNA 不請自來；EF 會緩慢的水解 GTP，在 GTP 沒有被水解之前，EF 抑制核糖體的進一步合成；而水解 GTP 的這段時間就是核糖體的等待時間，tRNA 可以隨時解離。

　　當 GTP 水解之后，EF 發生構象變化而離開，核糖體合成下一個肽鍵。這整個過程由于 GTP 水解釋放了大量能量，因而是不可逆的。

　　所以，堿基互補配對僅僅是提供了一個最基礎的區分，但是正確率最重要的決定因素，是 EF 上面 GTP 水解的速率。從指數衰減曲線可以看到，GTP 水解越慢，正確率越高；但是如果 GTP 水解過慢，正確的 tRNA 也會大量解離，降低合成蛋白質的效率。生物體就是在正確率和反應效率之間取了一個折中。

　　從這個里面也可以看到，蛋白合成的速率實際是由 GTP 水解速率控制的，雖然 GTP 水解并不直接參與催化肽鍵的形成。這樣就給了進化一個機會：影響正確率的突變，并不會直接干擾合成反應，于是這兩個步驟可以在一定程度上獨立演化。

　　對于 DNA 復制和 RNA 轉錄，類似的過程也在進行，這些酶的催化效率都遠沒有達到化學上可能的最高速率。 值得一提的是，在細菌中，由于 RNA 的轉錄和蛋白質的合成是同時進行的，蛋白質的合成速率成為了整個基因表達里面的限速步驟——只要 RNA 轉錄速率不慢于蛋白合成就不算拖后腿。而 RNA 轉錄越慢，mRNA 的正確率越高，所以在細菌中，RNA 聚合酶的延伸速率和核糖體合成蛋白的速率是幾乎一致的。

　　Kinetic proofreading 幾乎被用到了生物體內所有需要甄別相近的分子的步驟中。DNA 復制，RNA 轉錄，tRNA 合成，蛋白質合成，T 細胞識別抗原，SRP 識別信號肽…………而這一切的準確率竟然只需要微調一個獨立于反應本身的速率常數就可以調控，實在可謂是一個極為精巧的設計。

　　來源：daily.zhihu.com