(1)利用來源于C57BL/6小鼠的樹突狀細胞系DC2.4,探討聯(lián)合應用人TLR8激動劑CL075和TLR7/8調節(jié)劑Poly dT后,小鼠TLR8能否被激活以及TLR8激活以后對TLR8以及相關細胞因子如IL-10、IL-12和TNF-a表達的影響；(2)建立小鼠腫瘤模 型(Lewis肺癌模型),進一步探討TLR8激活對腫瘤生長的影響及其抗腫瘤免疫應答的調節(jié)機制；(3)利用臨床腫瘤標本(人宮頸癌組織)以及相關細胞 系(人宮頸癌Hela細胞),觀察TLR8在人體癌組織的表達以及TLR8激活以后對腫瘤細胞增殖和生存的影響,以便為以TLR8為靶點的腫瘤免疫治療提 供實驗和理論依據。方法：(1)在體外實驗中,DC2.4細胞用含有10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng),光學顯微鏡下觀察其經PBS、 CL075、Poly dT以及CL075與Poly dT聯(lián)合用藥刺激后的形態(tài)學變化；RT-PCR或qPT-PCR、免疫熒光法以及Western-blot檢測TLR8在DC2.4的表達與分 布；qPT-PCR、ELISA法檢測DC2.4經上述藥物刺激以后相關細胞因子TNF-α、IL-12和IL-10的表達；MTT比色法檢測TLR8激 動劑激活受體后對DC2.4抗原提呈功能的影響；qRT-PCR與Western-blot檢測經藥物刺激后對TLR8受體表達的影響。(2)在體內實驗 中,取純系C57BL/6小鼠,22-24克,雄性,隨機分成三組,每組10只。小鼠右側腹壁消毒后,皮下注射Lewis肺癌細胞3.0×106個細胞 /只,建立Lewis肺癌小鼠模型。Lewis細胞接種于小鼠當天即開始給藥,PBS、CL075和Poly dT均經腹腔注射給藥。CL0750.2μg+Poly dT5μg(低劑量組)每天給藥一次,PBS組、CL0752μg+Poly dT50μg(高劑量組)每兩天給藥一次。接種Lewis肺癌細胞第1天后,隔天用電子天平測量小鼠體重一次,7天后,用脫毛劑對各實驗組小鼠進行脫毛, 觀察腫瘤的生長情況。肉眼觀察并按摸皮下結節(jié),用游標卡尺隔天測量1次腫瘤結節(jié)的長徑a及短徑b,單位mm,根據公式V=1/2×axb2估算腫瘤體積。 給藥后第二十一天,在麻醉狀態(tài)下斷頸處死小鼠,取出腫瘤組織,用電子天平稱重,計算每組平均瘤重,qRT-PCR檢測小鼠脾臟及引流淋巴結中TLR8、 IL-12、TNF-α、IL-10、TGF-βFoxp3的表達,FCM檢測小鼠脾臟及引流淋巴結中CDllc+細胞TLR8的表達,FCM檢測小鼠脾 臟及引流淋巴結中CD3+CD8-IFN-γ+T細胞、CD3+CD8+IFNγ+T細胞以及CD4+CD25+Foxp3+T細胞的比例。(3)臨床標 本分析采用病人宮頸癌組織,并結合宮頸癌細胞系進行相關驗證工作。人宮頸癌細胞系Hela細胞用含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。采用RT- PCR/qRT-PCR、免疫熒光法檢測Hela細胞TLR8的表達與分布,流式細胞術、MTT比色法檢測TLR8激動劑CL075對宮頸癌細胞周期和細 胞凋亡的影響,qRT-PCR檢測COX-2.Bcl-2VEGF在經CL075刺激的人宮頸癌細胞株中的表達。取人宮頸癌組織及健康對照組樣 本,qRT-PCR檢鋇TLR7、TLR8與Bcl-2或VEGF的表達并分析其相關性,最后綜合分析TLR8在人宮頸癌細胞的表達及TLR8激動劑對腫 瘤增殖和存活的影響。結果:(1)光學顯微鏡下觀察發(fā)現,DC2.4細胞呈梭形、星狀和多角形,與成熟的樹突狀細胞相比,樹狀突起不長,個體較小,細胞透 亮,細胞核清晰。分別用PBS、CL075、Poly dT以及CL075+Poly dT刺激24h后,繼續(xù)在光鏡下觀察發(fā)現：經CL075+Poly dT聯(lián)合用藥刺激的DC2.4細胞樹突增多且伸長,而未刺激、單用CL075或Poly dT刺激的DC2.4細胞樹突較短且少。RT-PCR/qPT-PCR.免疫熒光法以及Western-blot分別從mRNA水平和蛋白水平證實 DC2.4細胞表達TLR8,而且TLR8主要分布于細胞漿內。通過qRT-PCR口ELISA檢測發(fā)現,與對照組相比,無論是mRNA水平還是蛋白水 平,CL075+Poly dT聯(lián)合用藥組細胞分泌TNF-α和IL-12的水平均顯著增加(*p<0.05),而IL-10的分泌水平顯著降低(*p<0.05).盡 管CL075處理組細胞TNF-α mRNA、TNF-α蛋白和IL-12mRNA水平也略有增加,但與對照組相比均無統(tǒng)計學意義,而Poly dT處理組DC2.4細胞TNF-α、IL-12和IL-10的mRNA和蛋白表達量均無變化。混合淋巴細胞反應實驗發(fā)現：與對照組相比,經 CL075+Poly dT刺激72h后的DC2.4可促進T淋巴細胞增殖(與對照組相比,**p<0.01),且T細胞與DC的比例為5：1時刺激作用更明顯。進一步的 研究發(fā)現,CL075+Poly dT聯(lián)合處理組的DC2.4細胞中TLR8mRNA和TLR8蛋白的表達量明顯高于陰性對照組(*p<0.05),CL075或Poly dT單獨處理組DC2.4細胞TLR8的表達量與陰性對照組相比無明顯變化。(2)小鼠體內實驗結果發(fā)現,腹腔注射CL075與Poly dT有效抑制了腫瘤的生長。CL075+Poly dT高劑量組小鼠的腫瘤體積與腫瘤重量明顯小于PBS對照組(*P<0.05,n=10)。與PBS組相比,CL0752μg+Ply dT50μg(高劑量)組、CL0750.2μg+Poly dT5μg(低劑量)組小鼠體重無明顯差別。qRT-PCR檢測發(fā)現,高劑量CL075+Poly dT可以顯著增加荷瘤小鼠脾臟和引流淋巴結IL-12mRNA的表達,引流淋巴結中TNF-α mRNA的表達也顯著增加,而抑制性細胞因子IL-10.TGF-βFoxp3的mRNA在脾臟和引流淋巴結中的表達量則明顯降低(與對照組相 比,*P<0.05或**P<0.01,n=4)。流式細胞術的實驗結果進一步證實,高劑量CL075+Poly dT可以促進脾臟和引流淋巴結中CD3+CD8-IFN-γ+T細胞和CD3+CD8+IFNγ+T細胞的增殖,而明顯抑制 CD4+CD25+Foxp3+T細胞的增殖(與對照組相比,*P<0.05或**P<0.01,n=6),證明CL075與PolydT聯(lián) 合應用一方面通過刺激荷瘤小鼠分泌IL-12、TNF-α等細胞因子,誘導Thl型應答和CD8+細胞毒作用,從而增強小鼠的抗腫瘤免疫應答；另一方 面,CL075與Poly dT合用,可通過減少荷瘤小鼠體內抑制性細胞因子如IL-10、TGF-β和Foxp3的表達,和抑制CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的增殖 而負向調控腫瘤免疫耐受,從而有效增強了荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫應答,延緩了腫瘤的發(fā)展進程。本研究同時還發(fā)現,與高劑量CL075+Poly dT目比,低劑量CL075+PolydT抑制腫瘤生長和增強抗腫瘤免疫的作用雖然不如高劑量明顯,但仍有一定的作用。而且,低劑量CL075+Poly dT可以明顯誘導脾臟和引流淋巴結中CDllc+細胞TLR8的表達,這和我們在體外實驗中發(fā)現的CL075與Poly dT合用誘導DC2.4細胞TLR8表達的實驗結果相一致。(3)我們采用RT-PCR和qRT-PCR檢測了包括Hela細胞在內的十三種人類腫瘤細胞 系,包括95D.HepG2.NICH446.U266.SGC.HCT-8. BGC.SW620.A549.HT1080.SKOV.3和U937等細胞TLR8的表達,結果發(fā)現,SKOV-3.U937和Hela表達高水平的 TLR8mRNA,胃癌SGC,HCT8,BGC,SW620,A549和HT1080表達低水平TLR8;而在95D.HepG2.NICH446或 U266細胞沒有檢測到TLR8mRNA.TLR8mRNA在宮頸癌細胞系中的表達水平顯著高于其他細胞系,免疫熒光染色表明Hela細胞表達TLR8蛋 白,而且TLR8分布于細胞漿內。用不同濃度的TLR8激動劑CL075處理HeLa細胞48小時后,流式細胞術檢測發(fā)現G2/M+S期細胞的百分比增 加,提示細胞增殖增加,這一結果被MTT法進一步證實。不同于順鉑,CL075沒有誘導Hela細胞凋亡。CL075(1μg/ml)處理24小時 后,Hela細胞中COX-2, BCL-2和VEGF mRNA水平顯著增加并在48小時達到峰值。定量RT-PCR結果表明,與沒有癌癥患者的宮頸組織相比,宮頸癌患者組織樣本中TLR7和TLR8 的]mRNA水平增高。與此相反,TLR9在癌癥患者和對照組組織樣本中的表達沒有明顯差異,此外,Bcl-2和VEGF在宮頸癌患者的癌組織中的表達水 平也顯著增加。采用Spearman分析,我們發(fā)現宮頸癌樣本中TLR8口Bcl-2或VEGF的表達水平之間存在正相關,而TLR7和Bcl-2或、 /EGF mRNA表達水平的變化并無明顯相關性。結論：(1)人TLR8激動劑CL075與TLR7/8調節(jié)劑Poly dT聯(lián)合應用可以有效激活小鼠TLR8,而且小鼠TLR8活化以后產生與人TLR8相似的效應,如誘導髓系樹突狀細胞分泌TNF-α、IL-12,減少 IL-10的分泌,有利于誘導Thl型免疫,增強DC的抗原提呈功能。因此,可以將[CL075+Poly dT]作為工具藥,以小鼠為模型體內外研究TLR8的功能。(2)TLR8可以作為腫瘤免疫治療的重要靶點。在體外,TLR8激動劑誘導DC2.4分泌 TNF-α和IL-12,增強DC2.4的抗原提呈功能,而且這些作用可能和DC2.4細胞TLR8的上調有關；在體內,TLR8激動劑促進荷瘤小鼠 Th1型免疫應答炎性細胞因子(TNF-α和IL-12)的產生、減少包括IL-10, TGF-β和Foxp3的免疫抑制因子的分泌,刺激CD3+CD8-IFN-γ+T細胞和CD3+CD8+IFN-γ+T細胞的增殖,抑制 CD4+CD25+Foxp3+T細胞的增殖,從而增強Lewis肺癌模型小鼠的抗腫瘤免疫應答,延緩腫瘤的發(fā)展進程,并且小劑量 CL075+PolydT上調樹突狀細胞TLR8的表達以增強其對激動劑的反應。這些結果表明,TLR8的活化以及DC等免疫細胞TLR8的上調有利于增 強抗腫瘤免疫應答。(3)然而,不同的腫瘤以及發(fā)生于不同個體的同一種腫瘤具有明顯的非均一性,因此TLR8及其激動劑的抗腫瘤作用需要全面評估,這在腫 瘤的個體化治療中具有十分重要的意義。人宮頸癌組織及宮頸癌細胞系高表達TLR8,這些腫瘤細胞也利用TLR8信號來創(chuàng)造有利于生長和生存的條件,如上調 Bcl-2和VEGF表達。這表明TLR8信號在腫瘤治療中可能是一把雙刃劍。TLR8及其激動劑在不同類型的腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用。